fPE7max traz a edição prime aos fungos e revela novas moléculas

Durante décadas, cientistas investiram milhares de milhões de dólares a sequenciar e a interpretar genomas de animais e culturas agrícolas. Já os fungos ficaram, em grande parte, para segundo plano.

Em geral, este reino só ganha destaque quando estraga o pão ou quando se instala nos dedos dos pés. É um esquecimento difícil de justificar, tendo em conta tudo o que os fungos já nos deram.

Os fungos construíram a medicina moderna

A penicilina nasceu de um bolor. E as estatinas - medicamentos para baixar o colesterol que milhões de pessoas tomam - também têm origem na química produzida por fungos.

“Este desinteresse é, de certa forma, notável, tendo em conta a forma como os fungos moldaram a medicina moderna”, afirmou Xue Gao, engenheira química e biomolecular na University of Pennsylvania.

“Desde a descoberta fortuita da penicilina até às estatinas que reduzem o colesterol, devemos muitos avanços recentes na longevidade à química fúngica. Mas, apesar disso, a esmagadora maioria do reino dos fungos continua a ser uma caixa negra.”

Porque é que os bolores de laboratório ficam silenciosos

Uma parte do problema está no próprio fungo. Na natureza, os bolores activam vias genéticas que produzem armas químicas para se defenderem de bactérias.

Quando esse mesmo fungo é colocado numa placa de laboratório limpa, essas vias desligam-se. Como nada o está a atacar, deixa de fabricar precisamente os compostos que os investigadores procuram.

Chegar a essas vias escondidas implica reescrever os genes que as mantêm bloqueadas - e é aí que a investigação tem esbarrado, ano após ano.

“Para voltar a ligar essas vias silenciosas, precisávamos de uma forma poderosa de manipular com precisão o genoma fúngico, por exemplo editando os seus genes reguladores-mestre, mas as ferramentas tradicionais não eram suficientes”, disse Gao.

Nova ferramenta de edição genética em fungos

Há mais de uma década que o CRISPR-Cas9 é o nome mais conhecido na edição genética. Contudo, em bolores filamentosos, comporta-se mais como um martelo do que como um bisturi.

O método corta as duas cadeias de ADN, e a célula remenda a ruptura de forma pouco precisa. Isso pode gerar inserções e deleções inesperadas, capazes de arruinar uma experiência planeada ao detalhe.

Uma abordagem mais recente, chamada edição prime (prime editing), evita por completo essas quebras duplas. Em vez disso, reescreve o código genético letra a letra, com um controlo muito mais fino.

Até aqui, ninguém tinha conseguido pôr a edição prime a funcionar em fungos filamentosos. Gao e a sua equipa, em Penn, desenvolveram uma versão que funciona e baptizaram-na de fPE7max.

Dois problemas, duas correcções

Para lá chegar, foi necessário ultrapassar dois obstáculos persistentes. O primeiro tinha a ver com instruções demasiado frágeis.

A edição prime depende de um guia de ARN que indica à ferramenta onde actuar e o que escrever. Quando a alteração é grande, esse guia torna-se comprido - e guias compridos tendem a degradar-se antes de o processo terminar.

A solução do grupo foi uma proteína chamada fLa. Esta proteína envolve o ARN delicado e protege-o, permitindo à ferramenta executar inserções e deleções de maior dimensão que fariam falhar sistemas menos robustos.

Numa fase inicial, a equipa usou uma versão desta proteína de origem humana, mas ela não funcionou bem dentro das células fúngicas. Trocar para a versão do próprio fungo foi decisivo.

O segundo obstáculo foi a resistência do fungo à edição. O seu sistema natural de reparação interpreta cada mudança introduzida como um erro e desfaz a alteração.

Por isso, os investigadores acrescentaram uma segunda proteína que, durante um curto período, reduz a actividade desse mecanismo de reparação.

Com as duas melhorias a actuar em conjunto, a fPE7max alcançou uma precisão de edição próxima de 90 por cento e manteve-se consistente em muitos genes e em várias espécies.

Remover os travões genéticos dos fungos

Depois veio a parte mais elegante do trabalho. A equipa direccionou a ferramenta para um gene regulador-mestre chamado laeA.

Este único gene comanda redes extensas de produção química: ao mexer nele, dezenas de vias a jusante reagem.

Imediatamente a montante de laeA existem pequenas sequências genéticas que funcionam como um travão.

Em vez de interferirem directamente com laeA, os investigadores usaram a fPE7max para recortar esse travão com precisão milimétrica.

Sem essa limitação, laeA aumentou a actividade. Conjuntos de genes que estavam adormecidos despertaram, e começaram a surgir compostos desconhecidos em fungos que nunca os tinham produzido em condições de laboratório.

A mesma estratégia funcionou em bolores muito distantes entre si na árvore genealógica dos fungos, o que sugere que o método poderá ser aplicado de forma ampla em todo o reino.

Descobertas moléculas fúngicas escondidas

O retorno foi significativo.

“Isolámos 18 moléculas complexas distintas, oito das quais tinham estruturas químicas totalmente novas para a ciência”, afirmou Chunxiao Sun, investigador de pós-doutoramento no Gao Lab.

“Entre estas moléculas reveladas, três exibiram propriedades anti-cancro promissoras. Estas moléculas podem servir como compostos líderes para o tratamento de doenças, fornecendo uma nova via vital para a descoberta de fármacos”, disse Sun.

Várias das novas descobertas pertenciam a uma família química chamada piranonigrinas. Algumas incorporavam blocos de construção que nunca tinham sido vistos integrados nesse esqueleto químico.

Três que atacam células cancerígenas

Primeiro, a equipa avaliou os novos compostos contra bactérias comuns e leveduras. Nesses testes, não se observou grande efeito.

Já perante células cancerígenas humanas, o cenário mudou de forma marcada. Uma das moléculas mostrou toxicidade selectiva contra células de cancro da mama, do fígado e de leucemia, deixando outras células em grande parte intactas.

Ficou claro que detalhes estruturais mínimos podem ser determinantes. Uma única cadeia lateral contendo enxofre pareceu decidir se uma molécula conseguia eliminar células cancerígenas ou se não tinha efeito.

Quando essa característica foi removida, a actividade desapareceu. Este tipo de pista ajuda os químicos a perceber o que torna um composto eficaz - e de que forma o podem optimizar.

O que se segue

O resultado aponta para uma reserva muito maior, à vista de todos. Mais de 90 por cento dos clusters genéticos fúngicos continuam por caracterizar, o que significa que existe um enorme património químico ainda por explorar.

“É uma prova de conceito convincente de que a próxima geração de terapêuticas que salvam vidas pode já existir na natureza”, disse Gao.

Agora, a equipa quer aplicar a fPE7max a muitas mais espécies de fungos.

A ideia é abandonar o antigo método de caça ao tesouro - vasculhar fungos selvagens à espera de um golpe de sorte - e substituí-lo por uma abordagem sistemática e repetível.

Para um ramo da biologia que foi ignorado durante tanto tempo, trata-se de uma mudança real. A caixa negra começa, finalmente, a abrir-se.